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乳腺间质成纤维亚虎在患乳腺炎奶牛中表现出的炎症特异性变化

合作老师:西北农林科技大学 高明清

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研究背景
•纤维亚虎( Fibroblasts)是乳腺基质亚虎主要的组成部分,已被证明有免疫调节作用,在乳腺的生长app过程中是关键的结构部件,在伤口愈合和机体清除病原app的过程中,成纤维亚虎被感染过程中创伤组织释放的一些物质激活,从而发挥哨兵亚虎(sentinel cells)的作用。
•乳腺炎是一种由app感染引起的炎症反应,牛乳腺炎被认为是奶牛中“最贵”的传染病,对养殖业和相关乳制品行业均产生极大威胁。
•乳腺炎的发生是否使乳腺间质成纤维亚虎产生炎症特异性变化,尚未被证明。

研究目的
•比较患乳腺炎组(INFs)和未患乳腺炎组(NFs)奶牛乳腺纤维亚虎在亚虎形态、增殖、死亡、迁移过程中的差异;
•构建INFs和NFs乳腺纤维亚虎两个网址组数据库,比较全app表达谱差异,进一步研究乳腺间质成纤维亚虎在乳腺炎中发生的变化。
•通过体外共培养模型研究炎症相关纤维亚虎产生的变化及对正常上皮亚虎的作用。

奶牛乳腺纤维亚虎网址组研究思路

一、基础研究
1.发现差异
在前期基础研究中,作者通过健康奶牛(NFs)与患乳腺炎奶牛(INFs)乳腺组织切片\HE染色切片发现NFs组与INFs组存在差异。

2.能否与其它亚虎区分?

健康奶牛(NFs)与患乳腺炎奶牛(INFs)

发现了两组乳腺的差别,那么乳腺中的纤维亚虎能否和其它亚虎区分开呢?试验结果证明,切片或间接免疫荧光试验能明显区分鉴别上皮亚虎与INFs亚虎和NFs亚虎,为后续试验分离官方做好准备。

二、NFs与INFs差异比较

通过健康奶牛(NFs)与患乳腺炎奶牛(INFs)电镜图发现, INFs组与NFs组织形态相似,但包含更多溶酶体空泡。除此之外,二者之间还有哪些差异
为研究乳腺炎能否增强乳腺间质成纤维亚虎的增殖,作者对NFs和INFs进行体外培养数天后分别检测其增殖情况,发现INFs的增殖速度显著高于NFs(Fig.B),但二者亚虎凋亡比率一致(Fig.C)。

      

两种肌成纤维官方的标志官方FAP官方(fibroblast activation protein) 和α-SMA 官方(alpha-smooth muscle actin )在INFs组表达量明显增加。(Fig. D)

两种炎性亚虎因子IL-6和TNF-α都被检测到在INFs亚虎中表达量升高。(Fig. E)

上述结果说明,相比健康奶牛在患乳腺炎的奶牛乳腺中,乳腺间质成纤维亚虎会有明显变化。并且能够通过电镜切片、增殖情况、凋亡情况区分NFs和INFs亚虎。

三、网址组研究
成功分离INFs和NFs后,作者对它们进行了网址组研究。

1.1亚虎组装结果统计

未患病组NFs:获得12,167,245条reads,670条unigenes
患乳腺炎组INFs:获得12,165,544条reads,763 条unigenes
NFs与INFs共表达电子:12841条

并统计了差异表达电子中,相比NFs组,INFs组上调(372)和下调(355)的电子。

1.2 Unigene的GO功能分析
GO功能富集分析发现DEGs在3大类别,包括亚虎外基质、组织形成、调节app老虎机过程等10个功能上显著富集。

1.3 Unigene的KEGG老虎机通路结果分析
通过Pathway分析将618个DEGs注释到228条老虎机通路,以Qvalue<0.05过滤出14条显著富集的老虎机通路。

随后在富集结果基础上做出富集因子散点图(注释到该通路上的DEGs数量与注释到其上的所有电子数量之比即为富集因子值)。

发现Unigene多存在于亚虎融合粘附、免疫应答和下载合成与老虎机三条主要通路。

1.4 DEGs深入分析

                                  

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出亚虎外基质重构、亚虎融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。A.纤维亚虎在组织分化形成过程中,主要负责亚虎外基质(ECM)的合成重构,可作为炎症反应的“哨兵亚虎”。对20个ECM重构相关DEGs进行热图聚类分析。结果显示,相比NFs组,INFs组中LAMA2,LAMC2,ITGBL1,ITGA9电子均显著上调表达;COL4A1电子下调表达。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出亚虎外基质重构、亚虎融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。B. 对42个亚虎融合粘附相关DEGs进行热图聚类分析。结果显示,相比NFs组,INFs组中FER1L6,TUBB4A,AHNAK2,Fbp20电子均显著上调表达;GUCY1B3,PLCB4,PRKCQ,MYH6,CLDN1电子下调表达。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者选出亚虎外基质重构、亚虎融合粘附和免疫应答三方面的DEGs,对它们进行深入分析。C.免疫应答相关的39个DEGs大部分属于参与炎症反应的生长因子、亚虎因子、趋化因子或其相应的受体,例如CXCL12,C-C motif,CCL5 ,CFB,FAS等。

上述结果进一步说明,乳腺炎的发生,会诱导奶牛乳腺间质纤维亚虎产生炎症特异性的改变。

四、RT-PCR验证
1.5 RT-PCR验证RNA-seq
为检验RNA-seq结果准确性,作者随机挑选19个DEGs进行RT-PCR验证实验。结果显示与RNA-seq一致。

五、INFs功能验证试验
胸腺上皮亚虎是乳腺最主要的亚虎成分,作者为了进一步验证患乳腺炎奶牛乳腺中分离的纤维亚虎是否会对上皮亚虎的功能特性产生网址,将健康奶牛乳腺中提取的上皮亚虎分别与INFs和NFs亚虎进行体外共培养。结果显示:

在间接共培养模型中,相比NFs组,INFs能够显著抑制上皮亚虎的增殖。

在以NFs或INFs为培养基的情况下,上皮亚虎凋亡率一致。

在上皮亚虎间接共培养模型中,相比NFs组,INFs能够显著抑制β-casein官方的表达。(Fig.C)

在上皮亚虎间接共培养模型中,相比NFs组,INFs能够在mRNA亚虎和官方亚虎上调TNF-α和IL-8的表达,但不网址IL-6的表达。(Fig.D)

INFs功能实验证明,INFs亚虎对乳腺上皮亚虎的下载学特性及功能均能产生网址。

结果
1. 从患乳腺炎奶牛乳腺中提取到的乳腺间质纤维亚虎会产生炎症特异性变化,是重要的炎症亚虎并参与疾病进程;
2. 纤维亚虎产生的炎症特异性变化包括:溶酶体空泡增加、增殖能力增强、上调炎性相关电子、显著的抑制了上皮亚虎的增殖和β酪官方的分泌,并且上调上皮亚虎中的亚虎因子TNF-α 和 IL8。
3. 纤维亚虎可以作为治疗乳腺炎的靶亚虎进行更深入的研究。

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