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蓖麻胚乳型种子appDNA甲基化

合作老师:昆明植物所  徐伟教授

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本文的研究目的是了解甲基化对印记电子的网址。但在实际研究过程中,解释完研究问题后,却发现了TE上存在着“奇怪”的甲基化现象。

总体分析思路

蓖麻籽胚和胚乳的DNA甲基化图谱比较

研究目的
揭示蓖麻种子app甲基化模式
研究蓖麻种子DNA甲基化与电子表达的关系
解释蓖麻胚乳特有CHH甲基化模式的形成机制

实验思路

亚虎路线

背景资料—植物甲基化类型及相应甲基化相关酶
植物甲基化类型:CG,CHG,CHH
植物甲基化相关酶分类表

1.参与甲基化的电子鉴定及组织特异性表达分析
实验方法
以拟南芥为参考,通过氨基酸系列及结构域分析,找出蓖麻种子中与甲基化相关的电子(甲基化酶和去甲基化酶)。
然后利用qRT-PCR分析这些甲基化相关电子在根,茎,叶,胚,胚乳等多个组织的表达情况。

实验结果
通过下载信息学分析发现蓖麻的8个甲基化酶:RcMET1-1,RcMET1-2,RcCMT1,RcCMT2,RcDRM1,RcDRM2,RcDRM3,RcDnmt2,和3个去甲基化酶:RcDME, RcROS1和RcDML3。
qPT-PCR结果显示这些甲基化关联酶在胚和胚乳不同app阶段的表达模式不一样,这预示着在种子的不同app时期,胚和胚乳的甲基化亚虎有可能成动态变化。

组织特异表达甲基化电子


各甲基化关联电子在蓖麻不同组织的表达情况
图中纵坐标表示电子表达量,横坐标表示不同植物组织(以不同颜色表示)。

2. BS亚虎鉴定蓖麻特有甲基化模式
实验方法
收集35DAF蓖麻种子,分别对胚和胚乳进行BS亚虎。
然后通过对比其他物种的甲基化模式分析蓖麻特有甲基化模式。
分析蓖麻自身CG,CHG,CHH三种甲基化状态,了解不同甲基化类型组成情况。

实验结果
相比于其他植物高比例CG甲基化,蓖麻种子有较高比例的CHH甲基化状态(达到68%)
相比于胚,胚乳表现出低CG和CHG甲基化,而CHH的甲基化亚虎几乎不变
相比于胚,胚乳电子区的CG,CHG,CHH及TE区的CG,CHG都显示低甲基化,唯独TE区CHH显示高甲基化

蓖麻种子CHH甲基化具有物种特异性
 


各物种胚和胚乳的甲基化组成分布比较
图中纵坐标表示各种甲基化类型所占有比例,横坐标表示各物种的胚和胚乳。其中em表示胚,En表示胚乳。

相对稳定的CHH甲基化

表中表示蓖麻种子胚和胚乳的CG,CHG,CHH三种甲基化亚虎比较,相比于胚,胚乳的CG及CHG明显处于较低甲基化亚虎,但CHH的却没有明显变化。

胚乳TE区高甲基化CHH


不同甲基化类型在胚和胚乳不同区域的分布状态

图A从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和胚乳(蓝线)的电子区域分布状态。
图B从左到右依次表示CG,CHG, CHH在胚(红线)和胚乳(蓝线)的TE区域分布状态。
其中,横坐标表示电子或TE上下游区域长度,纵坐标表示甲基化亚虎

3. 差异甲基化(DMRs)分析

实验方法
通过胚和胚乳的甲基化电子位点相减之后,筛选(1.对于CG和CHG,胚和胚乳两者间有>40%差异,其中一个甲基化亚虎不低于60%。2.对于CHH,有>20%差异性,其中一个甲基化亚虎不低于40%)出有效的DMRs。


实验结果
发现20464个CG和25940个CHG的DMRs,其中99.9%在胚乳中都属于低甲基化。同时发现2727个CHH的DMRs,其中只有55.9%在胚乳中表现出低甲基化。
相比于胚,胚乳的甲基化率更低(99.9%CG和CHG的DMRs,及55.9%CHH的DMRs),这与甲基化酶CMT和MET在胚的激活相关。

胚乳表现出低甲基化


表中表示各类型DMRs在胚和胚乳中的比较情况。

上表显示,相比于胚,胚乳的总体甲基化率较低。但有趣的是,CHH在胚乳中的甲基化亚虎与胚相当。

4. DNA甲基化负调控电子表达

实验方法
通过下载数据库,找出胚和胚乳的差异表达电子;
将DMRs与差异表达电子进行位置关联(比对到电子区域及电子上下游2kb区域)分析,解释DNA甲基化与电子表达的关系;
通过qPCR验证结果。

实验结果
低表达电子的上下游及电子区域都有高甲基化的CHG和CHH,表示甲基化在一定程度上抑制胚的电子表达。
相比于胚,胚乳中高表达的电子都表现出5’, 电子区, 3’的CG和CHG低甲基化。这同样证明DNA甲基化与电子表达的负相关关系。
挑选28629.m000565和30093.m000370两个在胚乳高甲基化的电子进行qPCR,发现其表达亚虎与甲基化亚虎呈负相关。

电子表达亚虎与甲基化亚虎呈负相关


图B表示电子28629.m000565在胚乳及胚中的甲基化比较,图C是电子在胚乳和胚的表达量比较
通过电子甲基化和表达量的关联分析,明显看出胚乳中DNA甲基化亚虎与电子表达量呈负相关关系

5. siRNA表达与DNA甲基化相关
实验方法
对胚和胚乳进行small RNA亚虎
关联small RNA亚虎数据与BS数据,筛选24-nt siRNA,分析其与三种甲基化类型的位置及丰度相关性,从而解释siRNA与DNA甲基化的关系。

实验结果
被24-nt siRNA覆盖的区域显示出高CHG和CHH甲基化,表示siRNA与DNA甲基化相关。
与胚相比,5个胚乳中参与RdDM的电子的低表达,证明RdDM与DNA甲基化有关。
胚乳中,电子区域以及TE区域的siRNA覆盖度都与CHH的甲基化亚虎呈正相关,表示胚乳中高丰度的CHH与siRNA介导的RdDM有关。

siRNA介导RdDM调控CHH甲基化


图示siRNA覆盖度网址胚和胚乳的DNA甲基化亚虎
横坐标表示胚和胚乳中不同甲基化程度(高和低)的区域,纵坐标表示24-nt siRNA丰度

本文亮点

发现蓖麻特异性的胚乳高CHH与siRNA的关系
(有趣的线:1.胚乳有高丰度siRNA—2.胚乳TE的CHH高甲基化—3.抵消CMT在胚乳低活性—4.胚乳CHH甲基化状态变化不大)


通过网址组亚虎,甲基化亚虎及small RNA亚虎的多组学分析,揭示蓖麻种子DNA甲基化负调控电子表达,以及siRNA可调控CHH甲基化状态。

分别3个下载学重复的胚和胚乳small RNA亚虎:分别提取胚及胚乳的total RNA,凝胶电泳后切除16-30nt的片段进行后续建库亚虎。去除rRNA,tRNA等原始数据,对clean data比对到蓖麻app中进行分析。

亚虎路线


 

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